Резюме :

В исследовании приведены результаты по изучению токсических, раздражающих, свойств Тилозина 50 разработанного ООО Фирмой «БиоХимФарм».

Установлено, что Тилозин50 является малотоксичным препаратом (4 класс опасности). При внутривенном введении белым мышам ЛД50 Тилозина 50 составила 660 мг/кг. После внутримышечного введения препарат быстро всасывался и обнаруживался в значительных количествах уже через 1 час после инъекции. Максимальные концентрации обнаруживали через 1-3 часов после инъекции. При однократном внутримышечном введении в дозе 10 мг ДВ/кг массы тела животного препарат обнаруживали в сыворотке крови в течение 24 часов. Препарат не обладает раздражающим кожно-резорбтивным действием.

Юрий Алексеевич Костыркин, к.в.н., ООО Фирма «БиоХимФарм»

Ключевые слова: антибиотик, тилозин, антимикробная активность, бактериостатическое и бактерицидное действие, острая и хроническая токсичность

Фирмой «БиоХимФарм» для ветеринарии была разработанна инъекционная лекарственная форма препарата, содержащая 5 % тилозина основания. Препарат получил название Тилозин 50.

Антибиотик тилозин образуется культурой Actinomyces fradiae. Наряду с “истинным” тилозином (компонент А) в процессе ферментации актиномицета получают и другие родственные продукты – десмикозин (компонент В), макроцин (компонент С), реломицин (компонент D). Тилозин относится к антибиотикам-макролидам. В химическом отношении тилозин представляет собой тиланолидное кольцо с сахарами микаминозой, микарозой, мицинозой.

По механизму действия тилозин относится к ингибиторам синтеза белка. Проникая в клетки путем пассивного транспорта, антибиотик угнетает активность фермента транслоказы, с помощью которой осуществляется продвижение рибосом по растущим полипептидным цепям вдоль информационной РНК. Кроме того, тилозин присоединяется к аминоацил- тРНК и пептидил-тРНК, нарушая процесс транслокации при синтезе белка в микробной клетке.

Тилозин, десмикозин и макроцин обладают сходным спектром антимикробной активности, проявляя при этом как бактериостатическое, так и бактерицидное действие, наиболее выраженное в отношении грамположительных бактерий. Но десмикозин и макроциклин токсичнее тилозина и оказывают иммунодепрессивное действие на макроорганизм. Наиболее чувствительны к тилозину микоплазмы и некоторые спирохеты, а также пастереллы, трепонемы, стафилококки, стрептококки, пневмококки, клостридии, эризипелотриксы. В отношении сальмонелл и эшерихий препарат активен только в очень высоких концентрациях, которые практически невозможно достигнуть в организме. Таким образом, по антимикробному спектру действия тилозиновые антибиотики идентичны другим макролидам.

Макролидам присущи ценные биологические свойства, отличающие их от беталактамов и аминогликозидов: высокая активность в отношении стафилококков, в том числе устойчивых к пенициллинам и цефалоспоринам, хорошая переносимость при приеме внутрь и высокая степень биодоступности, низкая токсичность для макроорганизма и отсутствие перекрестной резистентности с антибиотиками других групп.

Отличие тилозина от других макролидов заключается в выраженном антимикоплазменном действии и определенном тропизме при распределении в организме, а именно: при любых способах введения тилозин в высоких концентрациях обнаруживается в тканях легких и стенке кишечника. Этим и объясняется высокая эффективность тилозиновых препаратов при микоплазмозе.

При пероральном введении животным тилозин резорбируется главным образом в верхнем отделе кишечника. Максимальная концентрация в крови устанавливается через 1 — 4 часа после перорального введения, а после инъекции через 15-30 минут. Тилозин проникает во все органы и ткани, кроме головного мозга, создавая в них концентрации выше, чем в плазме крови. Наибольшие концентрации обнаруживают в легких, печени, почках и стенке кишечника. Концентрация, создаваемая в легких, значительно (в 2-7 раз) превышает концентрацию тилозина в крови. По сравнению с другими органами более продолжительное время антибиотик задерживается в почках и легких. Внутри бактериальных клеток наибольшее количество свободного антибиотика установлено в лизосомах, митохондриях и цитоплазме. Терапевтическая концентрация антибиотика после однократного применения сохраняется в организме 15-18 ч.

Из организма тилозин выводится с мочой и фекалиями. Количество тилозина, выделяемое с мочой, зависит от способа применения антибиотика. При пероральном введении почками выводится 2-5%, а при внутримышечном и внутривенном — 12-15% антибиотика. У птиц выведение тилозина из организма с яйцом прекращается после окончания его применения через 72 часа. Мясо обработанных скота и птицы можно считать свободным от тилозина спустя четыре дня со дня прекращения его применения. Это относится и к молоку.

Тилозин – малотоксичный антибиотик. Белые крысы и мыши переносят его пероральное применение в дозе 5000 мг/кг массы. ЛД50 при подкожном введении для мышей составляет 1000 — 2500 мг/кг, при внутривенном введении (475 — 550 мг/кг) и при внутрибрюшинном (600-2000 мг/кг массы тела).

Тилозин иногда может вызывать аллергические реакции. У свиней после введения антибиотика редко бывает воспалительная реакция кожи живота, слизистой наружных половых органов, степень которой зависит от возраста и физиологического состояния животных. Введение тилозина может сопровождаться отеком слизистой толстой кишки, диареей, эритемой и зудом, исчезающим после прекращения его применения(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13).

Современные условия ведения животноводства в России предъявляют к лекарственным средствам, применяемым в ветеринарии целый ряд требований, а именно:

удобство в применении, быстрая всасываемость и длительная элиминация, высокая лечебно-профилактическая эффективность, стабильность готовых лекарственных форм и низкая стоимость.

Целью наших исследований были изучение токсических, раздражающих, свойства Тилозина 50. .

Материалы и методы:

В первой серии опытов изучали острую токсичность Тилозина 50 в сравнении с зарегистрированным в Российской Федерации препаратом Тиланик производства фирмы «ВИК» (Россия). Острую токсичность Тилозина–50 изучали на 30 беспородных белых мышах массой 18-20 г. Препарат вводили однократно внутривенно подогретым до 37-380С в дозах 250, 500, 750, 1000 и 1250 мг тилозина основания на 1 кг массы тела (5, 10, 15, 20 и 25 мг/мышь). Для получения необходимых доз препарат перед введением разводили стерильной водой для инъекций. Острую токсичность Тиланика 5% раствора изучали на 30 беспородных мышах. Препарат вводили в дозах 275, 525, 775, 1025 и 1275 мг на кг массы. Срок наблюдения за подопытными животными – 7 суток. ЛД50 и другие параметры острой токсичности рассчитывали по Литчфилду-Уилкоксону.

Результаты и обсуждения

Показатели по острой токсичности препарата Тилозина 50 представлены в таблице

Таблица 1

Определение ЛД50 Тилозина 50 для мышей при внутривенном введении

Числитель – количество павших животных

Знаменатель – количество выживших животных

Х = 0,156

ЛД16 = 520 мг/кг

ЛД50 = 660 мг/кг

ЛД84 = 930 мг/кг

S = 1,33 N = 6

f ЛД50 = 1,37

нижняя доверительная граница ЛД50 = 460 мг/кг

верхняя доверительная граница ЛД50 = 899 мг/кг

размах испытанных доз R = 5 А = 1,056 fs = 3,1

нижняя доверительная граница S = 0,44

верхняя доверительная граница S = 4,12

В результате исследования установлено, что ЛД50 препарата тилозин — 50 (5% раствор) при внутривенном введении белым мышам составляет 660 мг/кг. Для сравнения, по данным Anderson et al., 1985 г., ЛД50 при внутривенном введении находится в пределах 320-600 мг/кг.

Показатели по острой токсичности препарата Тиланик 5% раствор представлены в таблице 2.

Таблица 2

Определение ЛД50 Тиланика 5% раствора для мышей при внутривенном введении («ВИК»).

Числитель – количество выживших животных

Знаменатель – количество павших животных

Х = 0,156

ЛД16 = 500 мг/кг

ЛД50 = 650 мг/кг

ЛД84 = 900 мг/кг

S = 1,34 N = 6

f ЛД50 = 1,38

нижняя доверительная граница ЛД50 = 470 мг/кг

верхняя доверительная граница ЛД50 = 895 мг/кг

размах испытанных доз R = 5 А = 1,057

fs = 3,1

нижняя доверительная граница S = 0,43

верхняя доверительная граница S = 4,15

В результате исследования установлено, что ЛД50 препарата тиланик 5% раствор при внутривенном введении белым мышам составляет 650 мг/кг.

Во второй серии опытов изучали хроническую токсичность Тилозина 50.

Материал и методы

Опыт проводили на белых крысах (80 гол.), которым вводили препарат в дозах 1/20, 1/10 и 1/5 от LD50. Тилозин 50 вводили ежедневно внутримышечно в течение 20 суток. Наблюдение за клиническим состоянием животных вели на протяжении 30 дней от начала опыта. Определение массы тела у всех животных проводили до начала введения препарата и подекадно. На 10-е, 20-е и 30-е сутки от начала введения препаратов определяли относительную массу (коэффициенты) внутренних органов крыс – печени, почек, легких, сердца, селезенки, тимуса, надпочечников и семенников.

Результаты и обсуждение

При изучении хронической токсичности препарата гибели белых крыс в опытных и контрольной группах на протяжении всего опыта не регистрировали. Препарат не вызывал существенных изменений в клиническом состоянии животных: поведение, аппетит, частота дыхания у всех животных опытных групп, как в период применения препарата, так и в течение 10 дней после окончания применения препарата оставались в пределах физиологической нормы.

Установлено, что препарат, в дозах 0,05 и 0,10 мл/кг не оказывает негативного влияния на интенсивность роста животных. В изученных дозах в течение курса введения препарата, подопытные животные не отличались от контрольных по приросту массы тела, и в конце эксперимента статистически достоверных различий по этому показателю не было обнаружено.

У крыс, которым препарат вводили внутримышечно в дозе 0,20 мл/кг массы тела, на протяжении всего опыта отмечали снижение прироста массы тела по отношению к контролю, что свидетельствует о токсическом действии препарата. Однако через 10 суток после последнего введения препарата среднесуточный прирост массы тела крыс приближается к среднесуточному приросту массы тела контрольных животных. Относительная масса внутренних органов крыс, которым применяли препарат внутримышечно в дозе 0,05 и 0,1мл/кг, существенно не отличались от контроля. В группе животных которым вводили препарат в дозе 0,20 мл/кг массы тела, была отмечена инъекция сосудов внутренних органов и их большее, по сравнению с контрольной группой кровенаполнение. Относительная масса почек опытных крыс по сравнению с контролем на 14 день была выше на 21,1%, через 21 день это увеличение было менее значительным – на 12,5%. Относительная масса печени опытных крыс (0,2 мл/кг) по сравнению с контролем на 14 день была выше на 27,4%, на 21 день – на 8,5%. Через 10 дней восстановительного периода, данные показатели у опытных животных восстанавливались до физиологических значений. Показатели крови животных которым многократн вводили тилозин представлены втаблице 3.

Таблица 3

Биохимические показатели крови белых крыс при многократном

внутримышечном введении тилозина 50 (21 день)

При исследовании крови животных, которым вводили Тилозин 50 в дозах 0,05 и 0,10 мл/кг массы тела, не отмечено достоверных изменений в морфологическом составе крови, и биохимических показателях по сравнению с показателями в крови животных контрольной группы.

При исследовании крови животных, которым вводили тилозин в дозах 0,05 и 0,10 мл/кг массы тела, не отмечено достоверных изменений в морфологическом составе крови, и биохимических показателях по сравнению с показателями в крови животных контрольной группы.

На фоне применения препарата в максимальной дозе (0,20 мл/кг), наблюдается изменение ряда биохимических показателей крови, характеризующих в основном состояние почек и печени. Так, к 14 дню от начала опыта, у крыс данной группы повысился уровень креатинина – на 48,2%, мочевины – 26,8%. При дальнейшем введении препарата в наивысшей дозе до 21 дня наблюдалось более выраженное увеличение данных показателей: креатинина – на 51,3%, мочевины – на 40,4%. Во все сроки исследования возрастала активность цитолитических ферментов: АсАТ – на 48,2-51,5%, АлАТ – на 67,9-60,3%, гаммаглутамилтрансферазы – на 60,8-67,5%. Активность ЩФ повышалась в 1,6-1,7 раза. Уровень общего билирубина сыворотки крови повышался в опытной группе на 67,6-68,6%.

При этом на 14 сутки отмечали выраженное увеличение количества α- и β-глобулинов на 48,3% и 62,8% соответственно, при умеренном снижении содержания в сыворотке крови альбуминов (на 14,4%) и γ-глобулинов (на 15,5%). На 21-е сутки эти изменения были менее выраженные.

Результаты и обсуждение

Все изменения в организме лабораторных животных, вызванные 21дн. введением препарата в высоких дозах, носили обратимый характер, о чем свидетельствует восстановление функций организма животных до нормы через 10 суток после отмены препарата.

Как однократное, так и длительное введение препарата белым мышам в дозах 0,03 и 0,15 мл/кг (1/50 и 1/10 дозы от LD50) в течение 20 дней не приводит к нарушениям моторно-эвакуаторной функции желудка, не влияет на перистальтическую активность тонкого кишечника и не изменяет распределение содержимого во всех отделах пищеварительного тракта.

При изучении кумулятивных свойств по методу P. Lime суммарно введенные дозы тилозина – 12,4 мл/кг для белых крыс не вызвали 50%-ной гибели животных. Это не позволило рассчитать коэффициент кумуляции по показателю смертельный эффект, но, учитывая, что введенные дозы составляют 12,8 ЛД50, то возможный коэффициент кумуляции превышает 12. Это свидетельствует об отсутствии кумулятивного эффекта у тилозина.

В третьей серии опытов изучали субхроническую токсичность Тилозина 50.

Материал и методы

Опыт проводили на телятах. Препарат вводили внутримышечно телятам в течении 14 дней в дозах 0,05, 0,1 и 0,2 мл/кг.

Результаты и обсуждение

Тилозин в изученных дозах не оказывал существенного влияния на клинический статус, скорость роста, поведение и аппетит телят. показатели клинического состояния телят всех групп в течение всего опыта находились в пределах физиологической нормы. В период всего опыта телята контрольной и опытных групп были подвижны, аппетит выражен, рефлексы сохранены.

Нарушений функций пищеварения и мочеотделения не установлено. Препарат в различных дозах не снижал скорости роста телят. Показатели крови телят, которым многократн вводили тилозин представлены в таблице 4.

Таблица 4

Показатели крови клинически здоровых телят при внутримышечном

применении тилозина 50 в течение 14 дней

Многократное применение его в условно-терапевтической и в 2 и 4 раза ее превышающей дозах существенно не влияло на морфологические и биохимические показатели крови. Была отмечена лишь тенденция повышения в пределах нормы уровня мочевины, креатинина и активности АлАТ.

В четвертой серии опытов изучали местнораздражающее действие Тилозина 50.

Материал и методы

В опытах на кроликах (при нанесении препарата в дозах 0,02-0,12 мл/см2). Площадь нанесения составляла 80-82 см2 (5% от общей поверхности тела животных). За два дня до эксперимента тщательно выстригали шерсть на спине, избегая механических повреждений кожных покровов. Экспозиция препарата составляла 4 часа, после чего кожу аккуратно протирали ватным тампоном, смоченным дистиллированной водой. Реакцию кожи на воздействие препарата оценивали через 1 и 16 часов после однократного нанесения. Учитывали функциональные нарушения кожи, характеризующиеся появлением различной степени выраженности эритемы, отека, трещин, изъязвлений, изменением температуры тела.

При определении раздражающих свойств препарата при внутрикожном способе введения проводили в опыте на 2 кроликах. Предварительно выстриженный участок кожи делили на 6 полей площадью 20 см2. В центре 3 полей каждого кролика вводили препарат внутрикожно в объеме 0,3 см3. Через 20 минут после введения внутривенно вводили 1% раствор трепанового синего в дозе 1 см3/кг массы тела кролика. Через 30, 60 и 180 минут после введения красителя оценивали окраску кожных зон в местах инъекции препарата по 8-бальной системе.

Для изучения влияния препарата на слизистую глаза в конъюнктивальный мешок правого глаза каждому кролику, закапывали однократно препарат в объеме 0,05 мл, а в левый глаз, который служил контролем закапывали физиологический раствор в таком же объеме. Через 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 и 6 часов после инстилляции препарата учитывали клиническое состояние организма животных (температуру тела, частоту пульса, количество дыхательных движений), а также изменение кровенаполнения конъюнктивы, наличие лакримации и выделений, состояние роговицы и век, оценивая согласно схеме, приведенной в таблице 5.

Результаты и обсуждение

Таблица 5

Балльная система оценки раздражающего действия препарата

на конъюнктиву глаза кроликов

В результате проведенных исследований местнораздражающего действия тилозина установлено, что при однократной аппликации на кожные покровы кроликам при плотности нанесения от 0,020 до 0,10 мл/см2 препарат не вызывает повреждение кожи в виде эритемы или ее отеков.

Изучение раздражающих свойств препарата на слизистые оболочки, проведенное на кроликах, показало, что через 60, 180 минут и 4 часа раздражающее действие препарата отсутствовало.

В пятой серии опытов местнораздражающее действие тилозина 50 производства ООО Фирма «БиоХимФарм» сравнивали с Тилаником 5% производства фирмы «Вик – здоровье животных».

Материалы и методы

Препараты вводили внутримышечно кроликам массой 2-2,5 кг. Для этого по принципу аналогов было сформировано 6 групп животных по 8 голов в каждой.

Тилозин-50 вводили животным первой группы, а кроликам второй группы вводили Тиланик 5% — из расчета 0,2 см3 на 1 кг массы тела.

Дозы испытуемых препаратов соответствуют их разовой терапевтической дозе для кроликов. Животные пятой и шестой групп служили контролем — им вводили физиологический раствор по 0,2 см3 и 0,05 см3 на голову соответственно. Препараты вводили внутримышечно в область бедра.

За животными в течение всего эксперимента (96 часов) вели наблюдение. Через каждые 24 часа после введения препаратов по 2 кролика из каждой группы подвергали эвтаназии, вскрывали и проводили визуальное (макроскопическое) исследование места введения. Препараты вводили внутримышечно в область бедра.

Результаты и обсуждение

Было установлено, что введение всех препаратов проходило безболезненно. В ходе наблюдения за животными в течение первых 60 минут после введения препаратов и далее 2 раза в сутки в ходе всего эксперимента нарушения двигательных функций конечностей не отмечали. Нарушений поведенческих реакций в виде угнетения и отказа от корма выявлено не было. При пальпации места введения через 6 и 24 часа после инъекции препаратов у животных всех групп болезненных припухлостей и уплотнения тканей не отмечали.

При патологоанатомическом вскрытии через 24, 36 и 72 часа после введения препаратов у животных всех групп отмечали незначительные кровоизлияния в мышцах и под фасциями в месте их прокола, что связано с механическим повреждением капилляров и мелких кровеносных сосудов иглой во время инъекции. Через 72-96 часов данные изменения самопроизвольно исчезали.

У кроликов, которым вводили испытуемые препараты Тилозин 50 и Тиланик 5%, вскрытых через 24 часа после инъекции, отмечалась большая кровенаполненность сосудов в месте введения, чем у животных контрольных групп. Также имела место незначительная гиперемия тканей. Указанные изменения сомопроизвольно проходили через 48-72 часа после введения препаратов. Прочих патологических изменений тканей (наличие значительной гиперемии, отека, некроза) в месте введения всех препаратов обнаружено не было.

Таким образом, в ходе эксперимента нами было установлено, что Тилозин 50 производства ООО Фирма «БиоХимФарм» также, как Тиланик 5% производства фирмы «Вик – здоровье животных» обладают слабым местнораздражающим действием при внутримышечном введении.

Выводы

1. Тилозин 50 является малотоксичным препаратом (4 класс опасности). При внутривенном введении белым мышам ЛД50 Тилозина 50 составила 660 мг/кг.

2. После внутримышечного введения Тилозин 50 быстро всасывался и обнаруживался в значительных количествах уже через 1 час после инъекции. Максимальные концентрации обнаруживали через 1-3 часов после инъекции.

3. После однократного внутримышечного введения Тилозина 50 в дозе 10 мг ДВ/кг массы тела животного антибиотик обнаруживали в сыворотке крови в течение 24 часов.

4. Тилозин 50 не обладает раздражающим и кожно-резорбтивным действием.

Литература

1. И.П. Ашмарин, А.А, Воробьев. Статистические методы в микробиологических исследованиях.- Ленинград, «Государственное издательство медицинской литературы», 1962, 180 с.; 2. Государственная фармакопея СССР, XI, вып.2.- М., «Медицина», 1990, 400 с.; 3. К. Дерффель. Статистика в аналитической химии.- М., Мир, 1994, 270 с.; 4. В.Ф. Ковалев, И.Б. Волков, Б.В. Виолин и др. Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны в ветеринарии. М.: Агропромиздат, 1988, 224 с. 5. В.Г. Кукес. Клиническая фармакокинетика. Теоретические, прикладные и аналитические аспекты.- М., ГЭОТАР-Медиа, 2009, 20 с.; 6. С.А. Куценко. Основы токсикологии. — Санкт — Петербург, 2002; 7. Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства. М., 1985; ГФ ХI, том 2, с.210-226).Internation al Conference on Harmonization (ICH), Text on Validation of Analytical Procedures (1994); 8. International Conference on Harmonization (ICH), Text on Validation of Analytical Procedures, (1994); 9. Unated States Pharmacopea. Validation of compendial methods, USP26-NF21 (2003) 10. Guidance for Industry. Analytical Procedures and Methods Validation Chemistry, Manufacturing and Controls Documentation. Draft guidance. U.S. Department of healh and Human Service. Food and drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologies Evaluation and Research (CDER), August (2000); 11. Consultative Document. Interchangeable multy-source pharmaceutical products: WHO draft guideline on marketing authorization requirements (1994) WHO Drug Information, 8(2): 71–83.; 12. Investigation of bioavailability and bioequivalence (1992) The rules governing medicinal products in the European Community, III: 149–168.; 13. Multisource (generic) pharmaceutical products: guidelines on registration requuirements to establish interchangeability (1996) WHO Technical Report Series, 863: 114–154.